Localización
- Edificio de apoio á investigación (CACTUS)
- Rúa de Constantino Candeira, 1. Campus Vida , 15782Santiago de Compostela
- Teléfonos
- 881 816 242
As proteínas dixírense cunha enzima, normalmente tripsina (Proteasa que rompe especificamente nos residuos Arxinina e Lisina se non van unidas a unha prolina), para a posterior análise por espectrometría de masas dos péptidos obtidos.
Tipos de dixestión:
- DIXESTIÓN EN XEL: emprégase o Kit da casa Millipore (In-Gel DigestZp kit) para dixerir proteínas resoltas vía electroforese 1D o 2D e de xeles tinguidos con Coomassie, Prata ou fluorescencia.
- DIXESTIÓN EN SOLUCIÓN: realízanse dixestións trípticas de mostras en solución.
Tipo de Mostras:
- En Disolución. Enviaranse as proteínas (1-10µg) nun tubo eppendorf, co nome das mostras indicado.
- En Xel. Enviaranse as bandas de xel (1-4 mm), nun tubo eppendorf en auga milli-Q. As bandas serán recortadas do xel adaptándose estritamente ao seu contorno, co fin de non incrementar a proporción de acrilamida na mostra.
Almacenamento dos xeles: Os xeles poden conservarse húmidos durante algunhas semanas en ácido acético ao 1% a 4ºC. As bandas recortadas do xel poden almacenarse conxeladas en auga ou acedo acético ao 1%. Os xeles secos poden ser válidos, mesmo despois de varios anos de conservación, sempre que as súas superficies non fosen contaminadas con pegadas ou po, nos que se atopen queratinas. Pero é mellor traballar con xeles húmidos libres de recubrimentos de plástico ou celulosa.
Xeles compatibles:
- Tipos de Xeles: Pode ser válido calquera tipo de xel de poliacrilamida, sendo fundamental que o grosor dos mesmos se atope entre 1 e 1.5 mm e que a porcentaxe de acrilamida (que se pode usar neste kit) sexa do 4-20%. O tamaño da peza do xel sería de 1-3 mm de diámetro para xeles 1D e de 1-2 mm de diámetro para xeles 2D. Debe terse especial precaución en non introducir no xel substancias estrañas que poidan intervir na análise mediante espectrometría de masas. Desta maneira, para evitar a presenza de restos de acrilamida non polimerizada, é aconsellable prolongar a polimerización toda unha noite.
- Métodos de tintura: Coomassie , Prata (evitar empregar Glutaraldehido), Fluorescencia.
Manipulación de mostras e xeles: as superficies e o material debe estar perfectamente limpo. Para a escisión pódese empregar un bisturí e unhas pinzas, ou unha punta refugable convenientemente recortada, tendo sempre coidado de que o devandito material se atope completamente limpo.
Reactivos compatibles con Espectrometría de masas:
|
REACTIVOS |
Concentración Máxima Permitida |
|
Disolventes: |
|
|
Disolventes |
Calidade HPLC |
|
Auga |
MilliQ |
|
DMSO |
Evitar |
|
DMF |
Evitar |
|
Aditivos: |
|
|
Urea, Guanidina |
< 2M |
|
HEPES, MOPS, Tris, NH4O, Ácido Octyl glucosido |
< 50mM |
|
Fosfatos |
< 10mM |
|
Glicerol, n-octil-b-glucopiranosido, LDAO |
<1%(V/V) |
|
Azida sódica, PEG2000, Triton X-100, RTX-100, NP-40, Tween, Zwitte |
<0.1%(V/V): |
|
TFA |
Baixos % |
|
SDS, CHAPS |
< 0.01%(V/V) |
|
NaOAc, NaCL |
Evitar |
|
|
|
Contaminación por queratinas: É esencial traballar coa maior limpeza posible, xa que a incorporación das proteínas contaminantes dificulta ou impide a identificación da proteína de interese. Os contaminantes máis frecuentes son a seroalbúmina bovina e as queratinas humanas, estas últimas abundan no po, as pegadas dactilares e o cabelo. Por esta razón haberá que poñer especial énfases na limpeza dos cristais que se empreguen na electroforeses e empregar solucións de tintura frescas. Nunca tocar o xel cos dedos, bisturís ou pinzas e calquera material que se empregue para recortar as manchas, débense limpar.
Instrumentación: Kit de Millipore con microplacas C18, ThermoMixer (Millipore).
- Proteínas en xel. Enviaranse as bandas de xel (1-4 mm), nun tubo eppendorf en auga milli-Q, co nome das mostras indicado. As bandas serán recortadas do xel adaptándose estritamente ao seu contorno, co fin de non incrementar a proporción de acrilamida na mostra. Seguiranse as recomendacións indicadas no apartado da preparación da mostra. Canto maior sexa a cantidade da proteína presente na mancha máis fácil resultará identificala, xa que só unha parte se recuperará para a análise no espectrómetro de masas. Co kit de Millipore pódense obter bos resultados con 100 fmoles de proteína de partida.
- Proteínas en disolución. Enviaranse as proteínas (1-10µg) nun tubo eppendorf, co nome das mostras indicado. Seguiranse as recomendacións indicadas no apartado da preparación da mostra. As mostras entregaranse na Unidade de masas e proteómica xunto coa solicitude debidamente cumprimentada, e unha imaxe do xel do que proceden os anuncios para analizar (caso de que as proteínas se fixesen en xel).
- Almacenamento dos xeles: Os xeles poden conservarse húmidos durante algunhas semanas en ácido acético ao 1 % a 4 º C. As bandas recortadas do xel poden almacenarse conxeladas en auga ou acedo acético ao 1 %. Os xeles secos poden ser válidos, mesmo despois de varios anos de conservación, sempre que as súas superficies non fosen contaminadas con pegadas ou po, nos que se atopen queratinas. Con todo, é mellor traballar con xeles húmidos libres de recubrimentos de plástico ou celulosa.
- Xeles compatibles:
- Tipos de xeles: Pode ser válido calquera tipo de xel de poliacrilamida, sendo fundamental que o grosor dos mesmos se atope entre 1 e 1.5 mm e que a porcentaxe de acrilamida (que se pode usar neste kit) sexa do 4-20 %. O tamaño da peza do xel sería de 1-3 mm de diámetro para xeles 1D e de 1-2 mm de diámetro para xeles 2D. Debe terse especial precaución en non introducir no xel substancias estrañas que poidan intervir na análise mediante espectrometría de masas. Desta maneira, para evitar a presenza de restos de acrilamida non polimerizada, é aconsellable prolongar a polimerización toda unha noite.
- Métodos de tinción: Comassie, prata (evitar empregar Glutaraldehido), fluorescencia.
- Reactivos compatibles con Espectrometría de masas:
- Disolventes: Empregar reactivos de grao de pureza para HPLC e agua milli-Q.
- Non interfiren: TFA, ac. fórmico, Beta-Mercaptoetanol, DTT, solventes orgánicos volátiles, HCL, NH4OH, ac. acético.
- Tolerables en unha concentración menor á indicada:
- < 2M: Urea Guanidina
- < 50mM: HEPES, MOPS, Tris, NH4O, Ácido Octyl glucosido.
- < 10mM: Fosfatos
- <1 %(V/V): Glicerol, n-octil-b-glucopiranosido, LDAO
- <0.1 %(V/V): Azida sódica, PEG2000, Triton X-100, RTX-100, NP-40, Tween, Zwitte.
- < 0.01 %(V/V):SDS, CHAPS.
- A Evitar: DMSO, DMF, NaOAc, NaCL.
- Manipulación de mostras e xeles: as superficies e o material debe estar perfectamente limpo. Para a escisión pódese empregar un bisturí e unhas pinzas, ou unha punta refugable convenientemente recortada, tendo sempre coidado de que o devandito material se atope completamente limpo.
- Contaminación por queratinas: É esencial traballar coa maior limpeza posible, xa que a incorporación das proteínas contaminantes dificulta ou impide a identificación da proteína de interese. Os contaminantes máis frecuentes son a seroalbúmina bovina e as queratinas humanas, estas últimas abundan no po, as pegadas dactilares e o cabelo. Por esta razón haberá que poñer especial énfase na limpeza dos cristais que se empreguen na electroforeses e empregar solucións de tintura frescas. Nunca tocar o xel cos dedos, bisturís ou pinzas e calquera material, que se empregue para recortar as manchas, débense limpar.
Unidade de Espectrometría de Masas e Proteómica
- Edificio de Apoio á Investigación (CACTUS)
- Rúa de Constantino Candeira, 1. Campus Vida , 15782Santiago de Compostela
- 881 816 242